Frankreich im Jahr 1572. Das Land ist religiös gespalten in das Lager der Katholiken und das der Hugenotten, der Anhänger der Reformation. Um den Frieden wieder herzustellen, wird Marguerite, die Schwester des katholischen Königs Karl IX. von Frankreich, mit dem hugenottischen Prinzen Henri, König von Navarra, verheiratet.

Erstes Bild
In der Provinz feiern katholische Adelige ein wildes Fest beim Grafen Nevers. Anlässlich der Friedensbemühungen ist erstmals ein Hugenotte eingeladen, der junge Raoul de Nangis. Raoul hat am Tag zuvor eine Frau vor Randalierern gerettet und sich in sie verliebt, ohne ihren Namen zu kennen. Ungebeten erscheint Marcel, Raouls alter Diener. Er provoziert die betrunkenen Herren mit einem hugenottischen Kampfchoral. Nevers muss die Party für kurze Zeit verlassen, weil eine unbekannte Frau ihn sprechen will. Neugierig beobachten die Männer das Rendezvous durch ein Schlüsselloch. Als auch Raoul die vermeintliche Mätresse des Frauenhelden Nevers begutachten will, erkennt er schockiert seine Geliebte. – Tatsächlich aber ist die Katholikin Valentine zu Nevers gekommen, um ihrer beider Verlobung zu lösen, weil auch sie sich in Raoul verliebt hat. – Kaum ist Nevers zurück auf dem Fest, überbringt der Page Urbain eine mysteriöse Einladung an Raoul. Plötzlich wird der hugenottische Außenseiter, der als einziger nicht begreift, dass die Einladung von der Königin Marguerite stammt, zum Star des Abends.

Zweites Bild
Marguerite möchte den Frieden zwischen Katholiken und Hugenotten durch eine weitere Hochzeit festigen: Ihre Hofdame Valentine soll den Hugenotten Raoul heiraten. Während ihres Bades nimmt sie ihm das Versprechen ab, die Unbekannte zu heiraten, die sie ihm zuführen wird. Raoul ist von seiner Gastgeberin entzückt. Vor den Augen der Hofgesellschaft lässt Marguerite Valentines Vater St. Bris, Raoul und Nevers einen Friedensvertrag unterschreiben. Dann wird die verschleierte Braut Valentine hereingeführt. Als aber Raoul in ihr die vermeintliche Mätresse Nevers erkennt, lehnt er die Braut ab und brüskiert so die Katholiken. Marguerite kann nur mit Mühe verhindern, dass Katholiken und Hugenotten aufeinander losgehen.

Drittes Bild
Während katholische Studenten mit Grisetten ihren Sonntag feiern, stören hugenottische Soldaten sie im Biergarten mit wilden Kriegsliedern. Die gegenseitigen Provokationen werden von Marcel unterbunden. In einer Kirche nebenan wurde Valentine gerade von ihrem Vater St. Bris mit Nevers verheiratet. Marcel überbringt St. Bris die Duellforderung des gekränkten Raoul. St. Bris nimmt die Forderung freudig an. Er schmiedet mit dem Katholiken Maurevert ein Komplott, um Raoul beim Duell zu töten. Valentine, die Raoul immer noch liebt, hat den Plan ihres Vaters belauscht und bittet Marcel, seinen Herrn zu warnen. Doch es ist zu spät, das Duell hat schon begonnen. Um den Mördern zuvorzukommen, ruft Marcel die anderen Hugenotten mit seinem Choral zur Hilfe, St. Bris ruft die katholischen Studenten. Beide Parteien gehen ungebremst aufeinander los. Von der verzweifelten Valentine gerufen, kann Marguerite der Prügelei Einhalt gebieten. Marguerites Verhör klärt endlich Raouls Missverständnis auf. Voller Reue bittet er nun um die Hand Valentines. Höhnisch weist St. Bris auf den Ehemann Nevers.

Viertes Bild
Raoul hat sich zu Valentine geschlichen. Doch bevor die beiden sich aussprechen können, muss sie ihn verstecken, denn die führenden Katholiken kommen zu einer Geheimversammlung ins Haus. Persönlich befiehlt Königinmutter Catherine de Médicis, die ketzerischen Hugenotten im Namen Gottes auszurotten. Nevers, der sich als einziger weigert, ist das erste Opfer. Mit kirchlichem Segen werden alle auf den Massenmord eingeschworen. – Raoul will seine Glaubensgenossen warnen. Valentine fleht ihn an, sich nicht in Gefahr zu bringen, doch nicht einmal ihr Liebesgeständnis kann ihn mehr aufhalten. Verstört folgt sie ihm in die Bartholomäusnacht.

Fünftes Bild
Das Massaker ist in vollem Gange. Zwischen den Leichen finden sich Valentine, Raoul und Marcel. Im Sterben singen einige Frauen ein letztes Mal den hugenottischen Choral. Valentine tritt zum hugenottischen Glauben über und wird von Marcel mit Raoul verheiratet. Die katholischen Mordkommandos kommen zurück. St. Bris selbst gibt den Befehl, die letzten Hugenotten zu erschießen.