Die in Berlin geborene tschechische Mezzosopranistin Stepanka Pucalkova absolvierte ihre Gesangstudien an der Universität Mozarteum Salzburg, wo sie bei Elisabeth Wilke studierte. 2012 schloss sie ihr Masterstudium im Fach Oper und Musiktheater bei Josef Wallnig und Eike Gramss mit der höchsten Auszeichnung ab. Im selben Jahr erhielt sie von der Stiftung Mozarteum Salzburg die Lilli Lehmann-Medaille. Sie wirkte in zahlreichen Produktionen der Universität Mozarteum Salzburg und des Landestheaters Salzburg mit. Im Sommer 2013 trat sie im Rahmen der Salzburger Festspiele als Lehrbube in »Die Meistersinger von Nürnberg« unter der Leitung von Daniele Gatti und Stefan Herheim auf. Ein Jahr später sang sie Sesto in »La clemenza di Tito« in Salzburg und am Teatro Romano Fiesole in Florenz. Im slowakischen Nationaltheater gastierte sie als Rosina in »Il barbiere di Siviglia« und als Annio in »La clemenza di Tito« sowie als Mercédès in »Carmen« am Vorarlberger Landestheater und Landestheater Salzburg. Als Gast sang sie den  Küchenjunge in »Rusalka« am Tiroler Landestheater in Innsbruck. Sie ist regelmäßiger Gast der Staatsoper Prag, wo sie 2014 als Page in »Salome« debütierte. Zudem interpretierte sie Partien wie u.a. Suzuki in »Madama Butterfly«, Stéphano in »Romeo et Juliette«, Erste Magd in »Elektra« und Dritte Dame in »Die Zauberflöte«. Mit »Die Zauberflöte« war sie im Herbst 2016 auf einer Tournee in Japan zu erleben. Bei den 50. Salzburger Osterfestspielen gab sie ihr Rollendebüt als Siegrune in »Die Walküre«, begleitet von der Sächsischen Staatskapelle Dresden und unter der Leitung von Christian Thielemann. Als Koproduktion mit dem Beijing Music Festival war die Produktion im Herbst 2017 auch in Peking zu erleben. Sie war Finalistin des Hans Gabor Belvedere Singing Competition 2015. Im Dezember 2016 gewann sie den Preis »Die beste weibliche Stimme«, der als zweiter Preis beim Concours International de Belcanto Vincenzo Bellini in Marseille verliehen wurde. In der Saison 2017/18 gab sie ihr Debüt im Nationaltheater Prag als Charlotte in Willy Deckers »Werther«-Inszenierung. Sie arbeitet regelmäßig mit dem Karlsbader Symphonieorchester, mit den Prager Symphonikern (FOK), der Salzburger Konzertgesellschaft und dem Czech Ensemble Baroque Orchestra. Seit Beginn der Spielzeit 2018/19 ist Stepanka Pucalkova Mitglied im Solistenensemble der Semperoper Dresden und gibt hier ihr Hausdebüt u.a. in den Neuproduktionen »Moses und Aron«, »Les Huguenots« und »4.48 Psychose« sowie als Mercédès in »Carmen«.