Als Sohn einer New Yorker Musikerfamilie wuchs John Fiore mit Musik auf. Seine Karriere begann bereits im Alter von 14 Jahren als Korrepetitor und Pianist für die jährlichen Richard Wagner »Ring«-Festspiele in Seattle. Ab 1984 arbeitete er als u.a. Assistent Conductor in Santa Fe, San Francisco, Chicago, und an der Metropolitan Opera New York. Von 1986 an arbeitete der Dirigent als Assistent für Zubin Mehta beim Maggio Musicale Fiorentino, für Daniel Barenboim bei den Bayreuther Festspielen und beim l'Orchestra dell’Accademia Nazionale di Santa Cecilia für Leonard Bernstein, der seine Arbeit stark prägte. Sein Debüt gab John Fiore 1986 in San Francisco mit »Faust«. 1993 dirigierte er an der Metropolitan Opera New York Aufführungen der erstmals hier gezeigten Oper »Rusalka«. 1994 leitete er die erste in Australien stattfindende Inszenierung von »Les Troyens« am Sydney Opera House. Als etablierter Dirigent mit einem großen Repertoire gastiert er regelmäßig an zahlreichen Opernhäusern weltweit wie der Bayerischen Staatsoper München, den Savonlinna-Opernfestspielen, der Metropolitan Opera New York, der Lyric Opera of Chicago, dem Sydney Opera House, der San Francisco Opera, der Seattle Opera, der Opéra National de Bordeaux und dem Grand Théâtre de Genève. Mit der Spielzeit 1999/2000 war John Fiore neben seiner Tätigkeit als Generalmusikdirektor der Düsseldorfer Symphoniker auch Chefdirigent an der Deutschen Oper am Rhein in Düsseldorf/Duisburg. Dort dirigierte er u.a. eine Neuproduktion von Puccinis »Il trittico« und Richard Wagners »Der Ring des Nibelungen«, die Premieren von »Elektra« und »Parsifal« sowie die Uraufführung von Christian Josts »Vipern«. 2005 übernahm er die musikalische Leitung des »Ring des Nibelungen« am Nationaltheater in Prag, eine Koproduktion mit der Deutschen Oper am Rhein. In seiner Abschlusssaison in Düsseldorf/Duisburg 2008/09 dirigierte John Fiore 17 verschiedene Opern, darunter Neuproduktionen wie »Die Frau ohne Schatten« und »Rusalka«, die Wiederaufnahmen von »Der Ring des Nibelungen«, »Les Troyens« und »Pelléas et Mélisande« sowie die fünf Janáček-Opern »Jenůfa«, »Katja Kabanowa«, »Das schlaue Füchslein«, »Die Sache Makropulos« und »Aus einem Totenhaus«. Von 2009  bis 2015 war John Fiore Musikdirektor am Opernhaus Oslo, wo er u.a. »Ariadne auf Naxos«, »Tosca«, »Lulu«, »Peter Grimes«, »Le Grand Macabre« und »Der fliegende Holländer«, eine Uraufführung von »Peer Gynt« und »Lohengrin« dirigierte. Neben seiner Operntätigkeit arbeitet der Dirigent regelmäßig mit Orchestern zusammen wie u.a. der Sächsischen Staatskapelle Dresden, dem Boston Symphony Orchestra, der Los Angeles Philharmonic, den Bamberger Symphonikern, dem Gürzenich-Orchester Köln, dem Konzerthausorchester Berlin und dem Orchestra dellʼAccademia Nazionale di Santa Cecilia. Zu John Fiores Engagements gehören u.a. »Der Fall von Arkun« am Nationaltheater Prag, »Tristan und Isolde« an der Oper Zürich und »Norma« an der Opéra National de Bordeaux. An der Semperoper Dresden dirigierte John Fiore bereits »La bohème«, »La Cenerentola«, »Nabucco«, »Der Nussknacker«, »Aida«, »Die Entführung aus dem Serail«, »Die Walküre«, »Un ballo in maschera«, »Fidelio« sowie »Der fliegende Holländer«. Kürzlich war er mit »Falstaff« und »Norma« in Genf und mit »Cavalleria rusticana/Pagliacci« an der Deutschen Oper Berlin zu erleben. In der Spielzeit 2017/18 stand John Fiore u.a. für die Neuproduktion »Les Troyens/Die Trojaner« am Pult der Sächsischen Staatskapelle. In der Saison 2019/20  kehrt er u.a. für die musikalische Leitung von »Die Fledermaus« und »Fidelio« zurück.